将过夜培养的细菌转移至50毫升的离心管中，进行5000g的离心处理1分钟，以收集细菌沉淀，弃去上清液。此过程需重复一次，使每管共计收集100毫升的细菌沉淀。通常，使用LB培养基培养大肠杆菌约16小时，调整至OD值2-4。离心速度推荐为5000g（约5000rpm），如发现沉淀不充分，需适当延长离心时间。过长或过快的离心可能使沉淀过于紧密，影响后续步骤中溶液I的添加和沉淀的分散。

接着，弃去上清液，再加入约50毫升的菌液，重复上述操作，并将离心管倒置于吸水纸上（可使用普通草纸），使液体彻底流尽。若细菌密度明显偏低，可考虑增加菌液的量，并再重复1-2次操作。每管用于高拷贝质粒时的菌量不应超过150毫升，而用于低拷贝质粒时应控制在200毫升以内，以免影响后续裂解效率。

下一步，向每管中加入5毫升的溶液I，充分重悬细菌沉淀。务必确保沉淀完全均匀，无可见的细菌团块，且确认溶液I中已添加RNaseA。使用vortex混合10-20秒，直至沉淀完全悬浮，形成均匀的悬浊液。如果没有vortex，也可用移液枪轻轻吹打沉淀，帮助其散开。

随后，每管加入5毫升的溶液II，轻轻颠倒离心管4-6次，在室温下静置1-2分钟，以确保细菌完全裂解，形成透明的液体。切勿使用vortex操作，以免导致基因组DNA断裂，从而污染最终提取的质粒。颠倒管数次后，液体应变得清澈且无团块。如果在使用溶液I后未获得均匀的悬液，可以适当增加颠倒次数，注意总的裂解时间不要超过5分钟。

接下来，每管加入7毫升的溶液III，并快速颠倒离心管4-6次以混合，此时会产生白色絮状物。再次强调，切勿使用vortex，颠倒次数应有限制，以确保最终质粒的质量。在12,000-14,000rpm的条件下，室温离心10分钟。如果离心机的最高转速低，需延长离心时间，例如在5000-6000rpm条件下需持续20-30分钟，确保沉淀充分。

在离心时，可以同时准备质粒纯化柱，并在其上标记。将离心后获得的上清液倒入或吸入到纯化柱中，再以12,000-14,000rpm离心2分钟，弃去收集管内的液体。质粒进入纯化柱后，无需等待即可直接进行离心。确保收集管继续保留以便后续使用。此步骤及后续步骤也需在12,000-14,000rpm下离心2分钟，如果离心机转速较低，需延长离心时间至5000-6000rpm的约5分钟，直至液体完全穿透柱子。若离心后有少量漂浮物，可以考虑再次离心或使用自制漏斗过滤去除。

然后，在质粒纯化柱中加入12毫升的溶液IV，进行12,000-14,000rpm离心2分钟，以清洗杂质，弃去收集管内液体。此时加入溶液IV后无需等待，直接进行离心，确保清洗彻底。接下来，再次在12,000-14,000rpm下离心2分钟，以去除残留液体，使痕量的乙醇完全挥发。务必在弃去收集管液体后再进行离心，以确保能够彻底清除微量的溶液IV，因为这些残留物会影响质粒的质量。

将质粒纯化柱放置于50毫升离心管上，加入2毫升的溶液V，静置2分钟。也可使用重蒸水或MillQ级纯水替代溶液V，但水的pH不应低于6.5。等待的时间可以稍长，以帮助提高质粒的产量。若希望得到高浓度质粒，可考虑加入1毫升溶液V进行洗脱，虽然这将导致质粒得率减少约5-10%，具体情况与样品相关。

最后，在12,000-14,000rpm下离心2分钟，所获得的液体即为转细胞级超纯质粒。通常，所得质粒的浓度约为0.1-0.3 mg/ml，可以直接用于细胞转染。为了获得更高浓度的质粒，可以使用异丙醇沉淀法进行浓缩，或采用常规的乙醇沉淀法。

具体操作为：加入70%常温的异丙醇，比例为待浓缩质粒体积的0.7倍（例如，1毫升质粒加入0.7毫升异丙醇），混合后在12000-14000rpm、4℃下离心10分钟，小心吸去上清液，避免触及沉淀。如果希望获得更高浓度的质粒，建议使用1毫升的洗脱液进行洗脱，之后转移至2毫升的离心管中进行异丙醇沉淀，这样操作更为便捷。异丙醇沉淀DNA为玻璃状近透明的颗粒状沉淀，观察难度相对较高。

从离心管中取出时应尽量轻柔，避免沉淀松动或颗粒悬浮至液体中。通常不推荐直接倾倒上清，若偏好此法，建议将上清倒入一个干净的离心管中，以便在沉淀被误倒出时仍可回收。为避免吸走沉淀，推荐使用移液枪缓慢吸去上清。

完成上述步骤后，需加入1毫升常温70%乙醇溶液，轻轻悬起质粒沉淀以充分清洗，再在12,000-14,000rpm、4℃下离心5-10分钟，小心吸去上清液，避免触碰沉淀。随后在5000-10000rpm、4℃下离心5-10秒，用20微升或200微升的移液器小心吸净残留液体，防止影响沉淀。在无明显液体可见后，加入适当体积的溶液（如溶液V、10mM Tris-Cl pH 8.5或Milli-Q级纯水）以溶解DNA。切忌过度干燥DNA样品，以免影响其溶解性。最佳情况下，在弱碱性条件下溶解DNA时，辅助以缓冲液反复冲洗管壁，以确保管壁上的DNA充分溶解。确保每一步操作遵循科学原则，可以有效提高质粒的纯度和浓度，让您的实验更加顺利和有效。

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